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【關鍵詞】 高效液相色譜
摘要 以1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯為衍生化試劑, 在充氮的氣氛下對魚油進行皂化處理, 所得皂化產物經正己烷萃取處理后進行柱前衍生化, 再以HPLC/MS分離和鑒定。通過對長鏈脂肪酸分子的標記處理, 其衍生物分子在質譜分析中呈現出雙鍵位置的規范信息。通過建立模型計算式, 借助不飽和脂肪酸的分子離子峰和特征碎片離子峰的質量數, 計算不飽和的碳碳雙鍵位置。共鑒定出23種脂肪酸。結果表明: 深海魚油主要由C12C22的脂肪酸組成, 多不飽和脂肪酸含量占67.08% (峰面積百分比,下同), 其中C16∶19十六碳烯酸 (11.7%); C16∶44, 7, 10, 13十六碳四烯酸 (2.91%); C18∶112十八碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15十八碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十碳五烯酸 (16.71%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十二碳六烯酸 (10.53%)。所建立的方法為不飽和脂肪酸碳鏈中雙鍵位置的確定提供了新的技術手段。
關鍵詞 高效液相色譜質譜, 柱前衍生, 魚油, 脂肪酸, 雙鍵位置
1 引言
脂肪酸廣泛分布于自然界中，是生物體內重要的營養和代謝產物，對調節生物體內各項生理和生物功能起著重要作用。尤其多不飽和脂肪酸的結構特征與生理功能的關系倍受關注。油脂中脂肪酸的GC/EIMS分析常采用甲酯或三甲基硅烷化，但該法不能確定多不飽和脂肪酸中碳碳雙鍵的位置，因為在電子轟擊下，雙鍵沿脂肪酸鏈明顯遷移[1～3]。本實驗通過柱前衍生以液相色譜/質譜（LC/MS/APCI）研究皂化后的深海魚油中脂肪酸的組成，用1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯 (BDEBS)作脂肪酸的柱前衍生試劑[4,5]，采用軟離子化檢測技術(大氣壓化學電離源，APCI) 解析了脂肪酸衍生物的相關質譜信息，確定了深海魚油中多不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵的位置。所建立的方法可望在醫藥、食品、生命科學等領域獲得廣泛應用。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑Agilent1100型高效液相色譜質譜聯用儀(Agilent公司)，配備四元梯度泵、100位自動進樣器、熒光檢測器和在線真空脫氣機；Agilent 1100 Series LC/MSD Trap，配備大氣壓化學電離源 (APCI)。1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯(自制，見文獻[4,5])；長鏈飽和及不飽和脂肪酸標準樣品(Sigma公司)；無水乙腈 (禹城化學試劑廠)用P2O5干燥后蒸餾處理,用于制備緩沖溶液的甲酸、氨水等均為分析純。純水由MilliQ超純水系統制備。
2.2 標準溶液的配制準確稱取定量脂肪酸標品，用光譜純乙腈配成1.0×10-2 mol/L的溶液（長鏈脂肪酸需加入少量DMF作為助溶劑）。稱取0.0404 g的1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯用DMF定容至10 mL，濃度為5.0×10-2 mol/L。相應低濃度的衍生試劑(5.0×10-3 mol/L)及低濃度脂肪酸(1.0×10-4 mol/L)的標準溶液分別用DMF和光譜純乙腈稀釋而成。
2.3 深海魚油的皂化和衍生 魚油皂化參考文獻[6]。取100 mg 深海魚油于具塞試管中，加入1.0 mL 2 mol/L KOH的乙醇溶液，充氮密封后，在100℃水浴反應0.5 h，取出冷卻至室溫。滴加2.0 mol/L HCl至pH 2.0,加入500 μL正己烷超聲處理2 min，靜止分層，用注射器吸掉水層后，用去離子水洗至pH 7.0。氮氣吹干，殘余物重新溶解在500 μL的乙腈中。向盛有10 mg無水K2CO3催化劑的2 mL安培瓶中依次加入180 μL DMF，50 μL混合脂肪酸的提取樣，120 μL衍生試劑溶液(5.0×10-3 mol/L)，封口后于85℃恒溫水浴下振蕩反應45 min，取出放冷后, 加入1000 μL乙腈水溶液（CH3CN/H2O,1∶1, Ｖ/Ｖ）稀釋后進樣10 μL分析。衍生反應概況如圖1所示。
2.4 色譜與質譜條件Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm，大連依利特公司)。流動相A: 50％乙腈水溶液內含30 mmol/L的甲酸/氨水緩沖液 (pH3.5)；B: 100％的乙腈。梯度條件：40 min由A到B (B保持10 min),流速為1.0 mL/min, 進樣量為10 μL，柱溫30℃。熒光激發和發射波長分別為333和390 nm。大氣壓化學電離源（APCI）：正離子檢測模式，噴霧壓力60 p.s.i (1p.s.i=6894.76 Pa)，干燥氣流量為5 L/min，干燥氣溫度350℃，氣化溫度450℃，毛細管電壓3500 V，電暈電流4000 nA（Pos）[5,6]。
圖1 1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與5,8,11,14,17二十碳五烯酸的衍生概況及質譜斷裂模式(略)
Fig.1 Ｓcheme of derivatization procedure using 1,2benzo3,4dihydrocarbazole9ethylbenzenesulfonate (BDEBS) as labeling reagent; and the profile of collisioninduced dissociation of representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5)
2.5 理論部分（雙鍵位置判定）借助質譜分析中所獲得的衍生物分子所對應的分子離子峰的質量數[MH]+（圖1所示），可推出公式 (1)～(7)，并由此確定長鏈飽和及不飽和脂肪酸的碳原子數目n。飽和脂肪酸：
Cn∶0 MH+-1=278+CnH2n-1; n=(MH+-278)/14(1)不飽和脂肪酸：
Cn∶1 MH+-1=278+CnH2n-3; n=(MH+-276)/14(2)
Cn∶2 MH+-1=278 + CnH2n-5; n=(MH+-274)/14 (3)
Cn∶3 MH+-1 = 278 + CnH2n-7; n=(MH+-272)/14(4)
Cn∶4 MH+-1 = 278+CnH2n-9; n=(MH+-270)/14(5)
Cn∶5 MH+-1 = 278 + CnH2n-11; n=(MH+-268)/14(6)
Cn∶6 MH+-1 = 278 + CnH2n-13; n=(MH+-266)/14(7)
公式中n為飽和及不飽和脂肪酸的碳原子數目；278為試劑分子母核結構部分的分子量；MH+ 為質譜確定的飽和及不飽和脂肪酸的分子離子峰的質量數。依據分子中雙鍵的斷裂模式見圖2。有質譜分析中所獲得的不飽和脂肪酸衍生物的特征碎片離子的質量數（雙鍵斷裂后產生的特征碎片離子），含1～6個碳碳雙鍵的脂肪酸鏈中。
圖2 脂肪酸衍生物中的碳碳雙鍵的質譜裂解示意圖(db: 雙鍵; CaH2a:末端雙鍵斷裂所丟失的小分子; CbH2b-2:末端第二個雙鍵斷裂后丟失的小分子)(略)
Fig.2 MS cleavage profile of collisioninduced dissociation of fatty acid derivative (db: double bond; CaH2a: losing of small molecule with the cleavage of double bond at the end of molecular carbon chain)
的雙鍵位置可由下列公式 (8)～(13)計算獲得：
Cn∶1 Cdb= (M+1-276)/14 (8)
Cn∶2 Cdb1 = (M+2-276)/14; Cdb2 = (M+1-274)/14(9)
Cn∶3 Cdb1 = (M+3-276)/14; Cdb2 = (M+2-274)/14; Cdb3 = (M+1-272)/14(10)
Cn∶4 Cdb1= (M+4-276)/14; Cdb2 = (M+3-274)/14; Cdb3 = (M+2-272)/14;
Cdb4 = (M+1-270)/14(11)
Cn∶5 Cdb1 = (M+5-276)/14; Cdb2 = (M+4-274)/14;
Cdb3 = (M+3-272) /14; Cdb4 = (M+2-270)/14; Cdb5 = (M+1-268)/14(12)
Cn∶6 Cdb1 = (M+6-276)/14; Cdb2 = (M+5-274)/14; Cdb3 = (M+4-272)/14;
Cdb4 = (M+3-270)/14; Cdb5 = (M+2-268)/14; Cdb6 = (M+1-266)/14(13)
公式中的 “dbx”; x = 1, 2,…6 代表雙鍵在脂肪酸碳鏈中的位置，M＋1到 M＋6是雙鍵斷裂后產生的特征碎片離子峰的質量數，實驗中涉及的長鏈脂肪酸的雙鍵最大數目為6， 即 x≤6；且有：M＋1＞M+2＞M+3＞M+４＞M＋5＞M+6; 對同時含有多個雙鍵脂肪酸的衍生物，質譜上所獲得的特征碎片離子應具有M＋1－ M+2＝M＋2－M＋3＝M＋3－M+4＝M+4－M+5＝M+5－M+6＝40個質量單位，參見圖1和圖2。
3 結果與討論
3.1 質譜解析質譜數據表明，所有脂肪酸衍生物表現出強烈的分子離子峰，其質量數為m/z [MH]+；分子離子碰撞裂解后產生的m/z 263.7和 245.7碎片峰為衍生試劑分子的母核結構的特征峰（見圖1）。飽和脂肪酸衍生物，以C14為例（見圖3）：分子離子峰 為474.1，母核結構的特征碎片離子為m/z 263.7和245.7，質譜圖中顯示的碎片峰相對簡單。含一個碳碳雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物，以C18∶1為例（見圖4）：分子離子峰 為m/z 528.1；失水離子峰m/z [MH]+-H2O (m/z 510.0)，表現出的特征碎片離子峰M+1，m/z 值在444.1，以及與之相鄰并相差12個質量單位的特征峰m/z 456.1。與m/z 444.1相差1～2兩個質量單位的碎片峰m/z 442.6 應歸屬于m/z 444.1的峰。依據等式 (8)，計算出被裂解雙鍵的首碳位置為 12 (Cdb=12)。由于其高質量端與之相鄰的峰為m/z 456.1，恰好相差 12 質量單位，它應歸屬于 C12 = C13 的裂解。
圖3 代表性的飽和十四酸(C14∶0) 的質譜概況圖 (A: MS分析; B: MS/MS分析)(略)
Fig.3 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of saturated tetradecanoic acid (C14, fatty acid) derivatized with BDEＢＳ as labeling agent
圖4 以12十八碳稀酸為代表的單不飽和脂肪酸衍生物的質譜裂解示意圖 (A: MS; B和C為MS/MS)(略)
Fig.4 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of monounsaturated 12octadecenoic acid (C18∶1, fatty acid) derivatized with BDETS as labeling reagent
含多個碳碳雙鍵的不飽和脂肪酸衍生物，以C20∶5為例 （見圖5）：分子離子峰 為MH+, m/z 5481；失水離子峰MH+-H2O (m/z 529.9)， 表現出的特征碎片離子峰M+1, m/z 506.1；M+2，m/z 466; M+3, m/z 425.7 (≈426); M+4, m/z 385.8 (≈386); M+5, m/z 346。這些特征碎片離子在其相鄰的高質量端都有一個與之相鄰的并相差12個質量單位的特征碎片峰，它們的質量數分別為m/z 517.9 (≈518); m/z 478; m/z 438; m/z 398.8 (≈400) 和m/z 358。依據等式 (6) 和 (12), 計算出被裂解雙鍵的首碳位置分別為17(Cdb1=17)、14(Cdb2=14、11(Cdb3=11)、8(Cdb4=8)和5(Cdb5=5), 所對應的被裂解的雙鍵位置分別為C17C18、C14C15、C11C12、C8C9和C5C6 (斷裂模式見圖1)。分析數據顯示, 飽和脂肪酸衍生物的質譜相對簡單, 不飽和脂肪酸隨雙鍵數目的增加, 質譜裂解碎片逐漸復雜, 本實驗條件下, 飽和脂肪酸衍生物大都沒有丟失水分子峰，僅表現出 [MH]+ 和衍生試劑母核分子的特征峰m/z 263.7和245.7; 而不飽和脂肪酸衍生物顯示出特有的失水碎片峰[MH]+-H2O 和特征碎片離子峰M＋1, M＋2…M＋n（其特征峰的個數主要有雙鍵的數目決定）。此外，對多不飽和脂肪酸而言，另一個顯著性的特征是所有特征碎片離子峰M＋1, M＋2……M＋n，它們相互之間有40個質量單位的差異，即相鄰的兩個雙鍵之間相差一個CHCHCH2的結構單元（見圖2）。這對于判斷多不飽和脂肪酸雙鍵位置時，尋找質譜圖中所顯示的特征碎片離子峰M＋1, M＋2……M＋n起著至關重要的作用。它將指導對特征碎片離子峰的正確判斷（有時這些特征碎片離子峰的峰度相對較低，或者與其它碎片峰相鄰，正確判斷存在一定難度）。對一個完全未知的組分而言，首先由質譜確定相應分子離子峰的質量數，進而由母核結構的特征碎片離子峰推斷該組分是含羧酸的衍生物（其它組分在該條件下不發生衍生化，芳香酸衍生化產率很低，該條件下僅為直鏈脂肪酸的10%左右）。將分子離子的質量數m/z [MH]+ 代入公式 (1) 或公式 (2)～(7)進行檢驗，所獲得的碳原子數n必需滿足整數值。在此基礎上尋找質譜圖上顯示的分子離子峰經裂解后產生的失水碎片峰[MH]+-H2O, 并由此推斷是否為飽和或者不飽和脂肪酸。斷定為不飽和脂肪酸后，根據計算所獲得的不飽和脂肪酸的雙鍵數目后，在質譜圖上尋找相應數目的特征碎片離子峰的質量數（對含單雙鍵的脂肪酸，借助于12個單位質量差更為容易；對多不飽和的脂肪酸，借助40個質量差的結構單元尤為重要）。
圖 5 以5,8,11,14,17二十碳五烯酸為代表的不飽和脂肪酸衍生物的質譜裂解示意圖(略)
Fig.5 Ｐrofile of ion current chromatogram and scanning of the isolated representative derivative of 5, 8, 11, 14, 17eicosapentaenoic acid (C20∶5) with BDEＢS as labeling reagent
Ａ． ＭＳ； Ｂ，Ｃ，Ｄ： ＭＳ／ＭＳ．
3.2 衍生條件優化及魚油樣品分離1,2苯并3,4二氫咔唑9乙基苯磺酸酯與脂肪酸的衍生化隨溶劑不同衍生化產率有顯著差異。實驗中分別選取苯、甲苯、乙腈、N,N二甲基甲酰胺(DMF，干燥后減壓蒸餾處理) 、四氫呋喃、二甲亞砜(DMSO，干燥后減壓蒸餾處理)作為溶劑體系，以C16∶0、C17∶0、C18∶1、C22∶0和C20∶4長鏈飽和及不飽和脂肪酸為代表，考察了衍生化產率。盡管DMSO具有和DMF相當的衍生效果，然而以DMSO為溶劑時所獲得的衍生物在色譜洗脫過程中導致較多的干擾峰（副反應產物多），實驗中選取DMF作衍生化溶劑。磺酸酯與脂肪酸的衍生化隨堿性催化劑的不同，反應產率不同，實驗中選取K2CO3、K2C2O4、Na2CO3、KAc和檸檬酸鉀等幾種堿性催化劑，對衍生化產率進行了考察，結果表明：K2CO3和Na2CO3具有最高的衍生產率。考慮到K2CO3在DMF中具有較大的溶解力，故實驗選取K2CO3。盡管衍生化產率隨K2CO3用量的增加而提高，但過高的用量會導致試劑的部分分解。實驗中選取K2CO3的用量為10 mg (用量約為衍生化試劑用量的30～40倍，按摩爾量計算)。對衍生化溫度的考察表明：衍生化產率隨溫度升高而提高，超過95℃后，由于副反應的發生衍生化產率隨之降低，實驗中選擇衍生溫度為85℃，衍生化時間45 min。按前述衍生條件，經LC分離的色譜圖見圖6。獲得的LC/MS/APCI總離子流見圖7。質譜數據解析結果列于表1。由表1可見，深海魚油主要由C12C22的飽和及不飽和脂肪酸組成，分離后不飽和脂肪酸的含量占67.08% （峰面積歸一化以15到45 min內流出的各組分進行計算）。 其中C16∶19十六碳烯酸 (117%); C16∶44, 7, 10, 13十六碳四烯酸 (2.91%); C18∶112十八碳烯酸 (11.1%); C18∶46, 9, 12, 15十八碳四烯酸 (3.62%); C20∶113二十碳烯酸 (1.21%); C20∶55, 8, 11, 14, 17二十碳五烯酸 (1671%); C22∶62, 5, 8, 11, 14, 17二十二碳六烯酸 (10.53%) 等不飽和長鏈脂肪酸是魚油的主要組分。
圖6 深海魚油脂肪酸的色譜分離圖 (峰標注見表1)(略)
Fig.6 Chromatogram of longchain fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)
圖7 深海魚油樣品質譜離子流圖 (峰標注見表1)(略)
Fig.7 MS ion chromatogram of the isolated fatty acid derivatives from deepsea fish oil (peaks as in Table 1)
表1 深海魚油中脂肪酸衍生物的質譜解析數據(略)
Table 1 MS analysis of the fatty acid derivatives from deepsea fish oil sample
References
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6 Zou Yaohong(鄒耀洪). Chinese J． Anal． Chem．(分析化學), 2004, 32(1): 71～75
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